Molekilè jenetik metòd rechèch

Yo eksplore epi idantifye varyant nan estrikti ADN itilize metòd molekilè jenetik. Pou chak rejyon ADN, ki eksplore rejyon sa a nan kwomozòm, jèn la oswa allele alèl, metòd yo diferan. Kache chak metòd molekilè jenetik konprann kèk oswa lòt manipilasyon nan RNA ak ADN. Tout metòd sa yo yo karakterize pa yon konpleksite menmen, san yo pa kondisyon laboratwa pa ka te pote soti, ak anplwaye a dwe trè kalifye. Sa a se travay te pote soti nan plizyè etap.

etap

Premyèman, RNA oswa ADN echantiyon yo dwe pwodwi. Isit la, ka yon molekilè metòd jenetik dwe aplike nan pwatikman nenpòt materyèl: yon gout nan san, lekosit, fibroblast kilti, mukoza (grate), menm folikulèr yo cheve, - ADN ka jwenn nan nenpòt echantiyon. Li se apwopriye yo sèvi ak nenpòt ki metòd molekilè jenetik ak opsyon divès kalite yo epi yo te se tan izole ADN ki estoke nan frizè. se etap nan dezyèm dedye a akumulasyon nan fragman yo vle (anplifikasyon) nan ADN, kòm li ede asire reyaksyon an polimerizasyon chèn nan vitro (nan vitro san yo pa patisipasyon nan òganis k ap viv). Kòm yon rezilta, chwazi miltipliye yo fragman ADN pa sa a reyaksyon chèn, ak kantite lajan an nan ogmante ADN literalman dè milyon de fwa.

se etap la twazyèm nan metòd yo jenetik rechèch molekilè sipoze restriksyon miltipliye ADN (fwagmantasyon sa a, chire oswa koupe). Restriksyon sou fèt pa elektwoforèz sou yon poliakrilamid oswa agaroz jèl. Metòd sa a molekilè-jenetik nan etidye fragman ADN nan pèmèt tout moun yo pran yon pozisyon sèten nan jèl la. Apre sa, se jèl la trete yo ak ethidium bromur, ki kapab obligatwa nan ADN, iradyasyon an ak limyè iltravyolèt, lè sa a li se posib yo obsève pòsyon luminesans. Molekilè jenetik metòd dyagnostik yo varye ak anpil, men de premye etap sa yo yo komen nan tout. Men, nan lòd yo idantifye fragman ADN, ka jèl la ap gen koulè pal, ak anpil lòt metòd ki egziste deja.

espès

metòd ki pi dirèk ak toupatou pou detekte mikobakteri ka gen ladan pi wo a molekilè metòd aprantisaj la jenetik ADN. Sans li se ke, nan lòd yo idantifye materyèl nan chèn eskanè nan fragman espesifik nan ADN nan ajan patojèn. Molekilè jenetik teknik dyagnostik poko gen yon fason pi efikas yo rekonèt maladi tankou tibèkiloz. Lè l sèvi avèk reyaksyon an polimerizasyon chèn (PCR), ou kapab asire w ke ADN orijinal la pral ogmante kantite a nan kopi nan yon milyon fwa, se sa ki, pral gen anplifikasyon, epi li pral montre rezilta yo. Nivo a sansiblite se trè wo - plis pase katrevendis-senk pousan, ki se avantaj nan prensipal nan metòd sa a.

Rès la nan metòd yo molekilè-jenetik nan rechèch sou efikasite nan sede kopi miltip literalman double, depi nan ka sa a echantiyon an Desen montre yon sekans oligonukleotid espesifik ogmante a yon santèn ak sis fwa. Menm dyagnostik la kilti nan tibèkiloz nan sistèm lan respiratwa siyifikativman pi ba sansiblite li yo. Sa a se poukisa se medikaman modèn ki baze sou metòd molekilè jenetik nan dyagnostik pou maladi tibèkiloz la. Yon metòd dekri se efikas espesyalman lè fè fas ak ajan patojèn ki gen gwo variation antijenik, detèmine ki lòt fason se pi plis difisil - mande pou espesyal medya eleman nitritif ak kiltive tan long. Byochimik ak molekilè metòd jenetik pwodwi trè diferan efè sou rezilta yo.

dyagnostik pou tibèkiloz

Marshall PCR dyagnostik pou tibèkiloz pi souvan lè l sèvi avèk sekans moun ADN ki espesifik pou tout kat kalite maladi a. Pou yo rive nan objektif sa a yo itilize souvan prime ki detekte sekans IS eleman (IS-986, IS-6110), osi eleman sa yo karakterize espès trè migratè Mycobacterium tibèkiloz ak toujou prezan kopi miltip nan genomic la. Epitou ka fè ekstraksyon ADN ap pote soti nan kilti pi bon kalite ak nan klinik (krache nan pasyan) pa nenpòt lòt metòd ki apwopriye. Pou egzanp, gen metòd Boom ki kote zòn de defans la lysis itilize ki baze sou tyosyanat nan gwanidin ak silica kòm ADN nan konpayi asirans la. Nimewo a nan pasyan ki diferan pòv bakteryolojik ogmante chak ane, se poutèt sa nan antrene nan klinik te etabli yon nivo konplètman diferan òganizasyon nan: gen metòd molekilè-jenetik nan etidye ADN te jwe yon gwo wòl nan dyagnostik la.

Sepandan, nou dwe admèt ke li se pa san yo pa dezavantaj. Metòd la PCR se itilize nan souvan pote yon nimewo gwo fo-pozitif rezilta, ak rezon ki fè la se pa sèlman erè teknik, men tou, karakteristik yo ki nan metòd la tèt li. Anplis de sa, lè l sèvi avèk metòd sa a nan dyagnostik detèmine rantabilite nan mikobakteri, ki te idantifye, li se tou senpleman enposib. Men, dezavantaj sa a se pa pi enpòtan an. Molekilè metòd jenetik nan PCR diagnostics egzije risk pou yo kontaminasyon nan mikobakteryèn ADN. Sètifikasyon kondisyon pou rezon sa a ki pou laboratwa PCR fèt sèlman difisil, yo mande pou twa lokal ki apa a. PCR teknoloji se modèn ak trè konplèks, li mande pou yo sèvi ak ekipman ki apwopriye ak pèsonèl wo-antrene.

bacterioscopy

Lè rezilta yo dyagnostik pou analiz la yo dwe konpare ak lòt done: egzamen klinik, radyografi, tès mikwoskospi, rekòt e menm repons a yon tretman espesifik yo trè enpòtan. Nan seri sa a, syans yo PCR se sèlman youn nan eleman yo. Detekte patojèn lan nan dyagnostik la byen bonè ka pi senp ak pi rapid metòd yo - bakteryolojik.

Gen itilize yon mikwoskòp limyè (koloran Ziehl-Neelsen) ak fliyoresan (koloran fluorokrom). Avantaj la se vitès tès rezilta yo. Men, se dezavantaj li yo rezon konsidere kòm kapasite nan limite akòz sansiblite ki ba. Sepandan, se metòd sa a bay KI MOUN KI rekòmandasyon kòm ékonomi ki pi ak tè a yo detekte pasyan tibèkiloz. Deteksyon nan mikobakteri metòd bakteryolojik gen valè prediksyon ak estime eskresyon kantitativman bakteri. Pi plis konfyans fè fas ak li metòd molekilè rechèch jenetik nan maladi tibèkiloz la.

kilti

Pi bon deteksyon nan mikobakteri rekonèt syans kiltirèl. Simen materyèl pathologie li se te fè nan mwayen a ze: Mordovsky, Finn Mondyal la, LJ, ak renmen an. Referans nan rezistans a mikobakteri a medikaman ak endirèk prèv ki montre efikasite nan yon kantite mikobakteri ak koloni yo nan vitro, si metòd la aplike nan kilti rechèch. Pou ogmante pousantaj la nan izòlman nan mikobakteri vaksinasyon nan materyèl pathologie se ki te fèt sou anviwònman miltip.

Satisfè bezwen yo nan anpil kiltirèl, patojèn ki gen ladan sibvansyon ak likid. Yo itilize nan sistèm sa a ak otomatik ki fonksyone kalite mesure VANTES kwasans. Rekòt dwe ki te fèt nan enkubasyon pou jiska sèt a uit semèn. Nan tan sa a ka rekòt la ak mank la nan kwasans dwe konsidere negatif. Fason ki pi efikas yo detekte Mycobacterium tibèkiloz konsidere echantiyon byolojik: dyagnostik materyèl Enfekte kochon Gine, ki se trè sansib a TB.

Gen kèk figi

Enteresan jaden nan etid, ki te louvri pa diagnostics PCR te etidye M. tibèkiloz la - inaktif enfeksyon. Konsèp la modèn nan enfeksyon TB sijere ke soti nan yon santèn moun ki te an kontak ak M. tibèkiloz, katrevendis-pouvwa byen dwe enfekte, men se sèlman dis nan yo se se maladi aktif ap devlope. Gen lòt ki gen iminite TB, epi paske katrevendis pousan nan ka yo enfeksyon an rete inaktif. Detekte yon modèl li te te ede yon molekilè metòd jenetik.

Jenetisyen di ke senkant-senk pousan nan moun ki gen rekòt pathologie materyèl te negatif, ak katreven pousan nan moun ki enfekte avèk M. tibèkiloz, men ap koule tankou dlo ki pa gen okenn manifestasyon radyolojik nan maladi, PCR repons pozitif resevwa yo. Li se yon jenetik metòd dyagnostik te ede yo idantifye pasyan yo nan risk pa syans PCR, ak rezilta yo nan analiz yo (mikwoskospi ak kilti) yo te negatif, ak enfraklinik enfeksyon M. tibèkiloz te prezan.

rechèch modèn

Federasyon Larisi la ak laboratwa bakteryolojik sèvi ak yon metòd akselere nan konsantrasyon absoli: nitrat aktivite rediktaz nan mikobakteri teste pa Griess reaktif. sant Anti-TB sèvi ak yon metòd ki pèmèt yo detèmine rezistans dwòg. Sa a plantasyon nan medya likid, kote otomatik radyometri ak sistèm fliyoresan kontablite kwasans nan mikobakteri. Se tankou yon analiz fè byen vit - jiska de semèn.

Kounye a, nouvo metòd yo te devlope: se rezistans dwòg nan mikobakteri mezire nan nivo genotype. Etid nan fòmil yo molekilè nan jèn rezistans, ak pou montre prezans la nan mikobakteri. jèn sa yo ki asosye ak rezistans nan sèten medikaman. Pou egzanp, kaza jèn, inhA, katG rezistan a isoniazid, rpoB jèn - rifampicin 16Sp jèn RNA ak rpsL - strèptomisin, emb1 - nan ethambutol, Gyra - yon fluorokinolon ak sou sa.

mitasyon

dyagnostik nan modèn siyifikativman ogmante metòd la molekilè-jenetik nivo pou etidye ADN ak pèmèt yo pote soti nan gwo-echèl syans nan mitasyon nan tout spectre yo. Koulye a, nou konnen ke mitasyon yo ki pi komen nan 516, 526 ak 531 kòdon yo jèn nan rpoB, ak idantifye rezistans a nan divès dwòg. Gen yon seri antye nan metòd pou sezisman nan mikobakteri lè l sèvi avèk pa sèlman metòd tradisyonèl - byochimik, byolojik ak kiltirèl, men tou, lajman ki itilize modèn molekilè teknik jenetik. Deja gen bon jan epi yo bay metòd la dyagnostik kòrèk pou deteksyon an nan maladi monojenik. Yo baze sou syans ADN nan zòn nan egzak la yon jèn an patikilye. Sa a se anjeneral yon pwosesis konplèks, tan konsome ak chè, men done yo ki se provided by molekilè analiz jenetik, se pi plis egzat ak enfòmatif pase done yo lòt analyses nan tout.

Li te gen lontan te konnen sa ADN nan pa chanje pou lavi a tout antye de òganis lan ke li se nan nenpòt selil odnakova nuklee, ak sa a fè li posib yo pran analiz la nan absoliman tout selil nan kò a, nan nenpòt ki etap nan ontojenèz. ka jèn nan domaje dwe detekte anvan aparans nan sentòm yo an premye nan maladi a plen-echèl klinik, osi byen ke nan sante moun etewozigòt, men li te gen yon mitasyon nan jèn la. Molekilè jenetik maladi éréditèr metòd dyagnostik pèmèt yo revele li yo (apwòch dirèk, ADN-diagnostics), osi byen ke yo analize segregasyon la nan maladi a nan fanmi an ak makè Lokal ADN (polimorfism jenetik), ki fè yo lye ak yon jèn domaje (sa vle di, apwòch la endirèk nan ADN-diagnostics). Dirèkteman oubyen endirèkteman - nenpòt diagnostics ADN se ki baze sou metòd yo pou idantifye yon pòsyon entèdi defini nan ADN imen an.

metòd dirèk

metòd dirèk nan dyagnostik ADN yo lè se koupab jèn maladi a éréditèr li te ye, osi byen li te ye, ak kalite mitasyon li yo. Pou egzanp, yon apwopriye metòd dirèk nan yon kantite maladi. Sa a kore Huntington a (ekstansyon CTG-either), Fenilsetoniri (R408W), fibwoz sistik (delF508, pi gwo mitasyon) ak renmen an. Avantaj nan prensipal nan metòd la dirèk se yon nèt-posede presizyon dyagnostik, epi pa gen okenn bezwen fè yon analiz ADN nan rès la nan fanmi an. Si se yon mitasyon nan jèn nan korespondan jwenn, li pèmèt egzakteman apwouve yon dyagnostik pou eredite, detèminasyon genotype pou tout rès fanmi an chay.

Se yon lòt avantaj de dyagnostik dirèk konsidere yo idantifye yon konpayi asirans etewozigòt nan mitasyon move soti nan fanmi ak paran ki te mouri nan maladi a. Sa a se laverite espesyalman pou maladi otosomal resesif. Dezavantaj nan metòd dirèk tou ki disponib. Pou ou kapab aplike yo, ou bezwen konnen egzakteman lokaliz nòmal jèn, Exon-intron estrikti a nan spectre li yo ak mitasyon li yo. Se pa tout maladi monojenik jodi a te resevwa enfòmasyon sa yo. Informativeness metòd dirèk pa ka konsidere kòm konplè, paske yon sèl ak nan menm jèn ka gen yon gwo kantite mitasyon pathologie ki lakòz devlopman nan maladi éréditèr.

metòd endirèk

metòd endirèk nan diagnostics ADN yo te itilize nan tout, nan lòt ka, si jèn nan domaje se pa sa idantifye, men se sèlman kromozomik, oswa si dyagnostik la liy pa t 'bay rezilta a (bagay sa yo rive, si jèn konplèks òganizasyon an molekilè oswa yon gwo limit, si gen yon anpil mitasyon pathologie). metòd endirèk fèt segregasyon analiz de makè polimorfik nan fanmi alelik. Makè yo te jwenn nan rejyon an kwomozomik menm oswa nouvèl se lye a maladi a epi yo reprezante sipresyon oswa parusyon, sibstitisyon pwen, repete, ak polimorfism yo se akòz diferan kantite selil ki nan blòk la.

Pi bon pou dyagnostik konsidere kòm mikrosatelit ak minisatelit polimorfism endirèk, ki fè yo lajman distribiye nan genomic imen an. valè yo eksprime nan kontni enfòmasyon segondè, si domaj nan distans la jenetik ant makè la ak jèn nan se pa twò gwo. Nan denyé ka sa, se presizyon nan estimasyon detèmine nan yon gwo limit frekans nan rekonbinezon ant makè a polimorfik ak domaj. Endirèk metòd dyagnostik tou bay obligatwa etap preliminè sou frekans allele alèl nan etid la popilasyon analize nan mitan pasyan yo ak transpòtè nan mitasyon, plis nesesite pou detèmine pwobabilite ki genyen pou rekonbinezon nonequilibrium ak Adhesion makè ak alèl mutant.

lòt metòd

segments kout nan RNA oswa ADN, osi byen ke yon sèl jèn vizualiz anba etid mikwoskopik pa kapab, Se poutèt sa, yo idantifye mitasyon bezwen pou molekilè dyagnostik jenetik. Gen yon "genomic Pwojè Imèn", osi byen ke lòt pwogrè nan jenetik molekilè anpil elaji posibilite pou dyagnostik la nan maladi éréditèr - tou de pre-ak apre akouchman. Metòd sa yo ka bay deteksyon bonè, epi fè yon poly- prediksyon ak maladi monojenik, ki gen premye pwan plas nan laj majè. Malerezman, akòz kapasite yo teknik nan syans molekilè jenetik yo pafwa pi lwen pase limit yo etik ke yo mete nan relasyon ak yon pòsyon tè, espesyalman lè dyagnostik la se nan adolesans ak timoun piti.

Estriktirèl ak nimerik anomali kwomozomik ki lakòz ki pi komen nan maladi ak kansè, ak anpil anomalies. aberasyon kwomozomik bezwen yo dwe idantifye yo, ki se enpòtan pou konsèy fanmi - evalye pwevwa a, ansanm ak risk repwodiksyon nan gwosès nan lavni. analiz kwomozòm se "etalon lò a" nan dyagnostik jenetik, men li se limite. Se sèlman metòd yo nan molekilè analiz jenetik ka fè plis, paske se la itilize klonaj teknoloji ki baze etikèt fliyoresan kapab nan sansiblite segondè yo yo idantifye chanjman kwomozomik sibtil ki enposib yo detekte klasik syans sitojenetik. Teknik sa yo de pli zan pli agrandi kapasite dyagnostik nou an, lè egzamine, timoun ki gen andikap devlopman, reta mantal, ak anpil lòt maladi éréditèr.

konklizyon

Li trè enpòtan pou limanite te estrikti nan jèn ak fonksyon nan konesans, kalite variation, kapasite nan detekte maladi éréditèr ki te fèt an koneksyon avèk devlopman nan jenetik molekilè. metòd li yo se nan bi pou etid la nan molekil la ADN - ak lè li se yon bagay nòmal, epi lè li se domaje. Preparasyon nan sekans asid deoxyribonucleic nan nucleotides (ADN) fin nan premye etap pou resevwa echantiyon yo idantifye fragman endividyèl elèv yo. Izolasyon nan ADN jenetik soti nan selil yo, restriksyon (chire), anplifikasyon (klonaj), elektwoforèz nan fragman yo (separe chaj elektrik yo ak pwa molekilè pa agaroz jèl). Idantifikasyon nan fragman espesifik ki chita sou sifas la nan yon foule disrè.

Lè sa a, ap resevwa nan zak filtè yo espesyal, nan ki pase chak ibridasyon fragman ak fragman ADN klonaj oswa sentetik sond radyo-aktif se yon kontwòl, ki pral egal a chak echantiyon egzamen an. Si w chanje pozisyon nan oswa longè konpare ak pwofonde a, si yon nouvo fragman oswa disparèt - tout sa a sijere ke te jèn nan analize sibi restriktirasyon nan sekans ki nukleotid. Gen uit teknik debaz nan syans molekilè jenetik: sekans (detèminasyon nan sekans ADN), polimerizasyon reyaksyon chèn (ogmantasyon nan kantite a nan sekans), preparasyon an nan prime li te ye jèn, klonaj ADN, pwodiksyon de molekil recombinant sòti pwoteyin akòz molekil recombinant, kreye yon ansanm konplè (koleksyon bibliyotèk) klone plen moso ki te yo te jwenn lè l sèvi avèk restriksyon.